2019年10月1日（rì），5-羟甲基化胞嘧（mì）啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖尿病（bìng）研究（jiū）领（lǐng）域取得重（chóng）要进展。2型糖尿（niào）病（bìng）（T2D）的血管（guǎn）并发症是导致2型糖尿病致残致死的重（chóng）要病因，一直缺乏（fá）一种无创便捷的（de）临床途径实（shí）现血管（guǎn）并发症的发生发展（zhǎn）监测，达（dá）到早发现、早干预（yù），以提高（gāo）T2D病人的整体生活（huó）质（zhì）量，减少卫生经济负（fù）担（dān）。

该研究入组了（le）62例2型糖尿病病人，采用5hmC-Seal技术对血浆cfDNA中表观（guān）遗传标志物5hmC的分（fèn）布情况进行检测，分析5hmC标志物与2型糖尿病血管并发症发生发展的相关（guān）性。结果表明5hmC标（biāo）志物的变化（huà）与T2D合并大血管/微血管事件具有相关性，主要涉及一些（xiē）与血管（guǎn）生物学和糖尿病（bìng）（包括胰岛素耐受和炎症反应（yīng））相关的基（jī）因和信号通路。该研究建立的16个基因（yīn）-5hmC标志物组（zǔ）合（hé）检（jiǎn）测可以准确区分（fèn）有并发症和无（wú）并发症的2型糖尿病病人[实验组（zǔ）：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优于传统临床变量例如白蛋白尿。除此之（zhī）外，还建立了13个基因-5hmC标志物组（zǔ）合检测（cè），可以（yǐ）进一（yī）步区分（fèn）T2D合并（bìng）单一并（bìng）发（fā）症和多种并（bìng）发症[实（shí）验组：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样明显（xiǎn）优于其他传（chuán）统临（lín）床变量。该研究得出结论，5hmC标（biāo）志物反映（yìng）了（le）T2D病人（rén）大（dà）血管/微血（xuè）管并发症发生过程中的表（biǎo）观遗（yí）传变化，因而5hmC-Seal检测技术在（zài）监测糖尿病血管并发症发生和进（jìn）展（zhǎn）方面具有良好（hǎo）的临床应（yīng）用前景。

本研究共（gòng）纳入62例2型糖尿病病人（rén），包括没有血管并发症的病人12例，有单一血管并发症（zhèng）的病（bìng）人34例（24例（lì）发生（shēng）大血管事件（jiàn），10例发生（shēng）微血管事件），以及有（yǒu）多种血管并发症的病人16例。试（shì）验收集（jí）62例病人血浆，提取（qǔ）cfDNA，利用5hmC-Seal技术捕获外周血cfDNA中的5hmC序列，进行（háng）二代测序，通（tōng）过生（shēng）物信息学分析找出（chū）并发症组与无并发症（zhèng）组之间有显（xiǎn）著5hmC修（xiū）饰差异的基因，单一并发症组（zǔ）和多种并发症组之间（jiān）有显著5hmC修饰差异（yì）的（de）基因。随后利用回（huí）归模型对（duì）差异基因进（jìn）一步筛选、优化，弹性网络进一（yī）步筛选，计算加权平均分，最后得到一组具有高度灵敏度和特异（yì）性的5hmC生物标（biāo）记物（wù），并进一步在实验组中（zhōng）验证，分析其灵敏度和特（tè）异性。并将（jiāng）新建（jiàn）立的5hmC标志物基因组（zǔ）合的检测性（xìng）能（néng）与（yǔ）传统临（lín）床变量进（jìn）行对比分析。最后对相关基因进行了信号（hào）通（tōng）路分析和（hé）功能（néng）探究。

5hmC修饰水平（píng）与血管并（bìng）发症具（jù）有相（xiàng）关性

利用逻（luó）辑回归模型对62例有（yǒu）并发症和无并发症（zhèng）2型糖尿病病人（rén）的5hmC差异水（shuǐ）平进行分析发现，有并发症2型糖尿病病人的622个差（chà）异修饰候选基（jī）因（包括上调和下调基因）的归一（yī）化平均数要明显高于无并发症的病人（P<0.001），但是单一并发症（zhèng）和多发并发症（zhèng）病人之间没有显著差异。

之后（hòu）将有单一（yī）并发症或多种并发症的50例病人用逻辑回归模型进行了（le）对比，发现多种并（bìng）发症（zhèng）的病人的153个差异修饰候选（xuǎn）基因（包括上调和下调基因）的归（guī）一化（huà）平均数要低于无并发症病人（P<0.001）。

5hmC标志物可区分有（yǒu）无（wú）并发症患（huàn）者

62例2型糖尿病病人被随机分成（chéng）训（xùn）练组（n=31）和（hé）测试组（n=31）。利（lì）用弹性网络筛选后发现，16基因-5hmC标志物组（zǔ）合检测可以用于区分有并发症（zhèng）和无并发症的2型糖尿病病人。

基于16基因（yīn）组合模型 (Detection Model 1) 的加权平均分分析，发现（xiàn）无并发症病（bìng）人的分数在训（xùn）练集和测（cè）试集（jí）中都明显低于有并（bìng）发症的病人（rén）。只考虑（lǜ）加权平均分的话，受试（shì）者工作（zuò）特征曲线（ROC）分析表明将cutoff值设置成（chéng）0.5时，在测试组（zǔ）中中的灵敏度为60%，特异性为100%。

5hmC标志（zhì）物可区分病人是单一并（bìng）发症还（hái）是多种并（bìng）发症

50例有并（bìng）发症的2型糖尿（niào）病病人被（bèi）随（suí）机（jī）分成训练组（n=25）和测试（shì）组（n=25）。利用弹性（xìng）网络筛选后（hòu）发现（xiàn），13基因-5hmC标志物（wù）组合可以区分（fèn）2型（xíng）糖尿病病人是否发生单（dān）一并发症（zhèng）或多种并发症。

基于13基因组合（hé）模型 (Detection Model 2)， 我们计算了单（dān）一并发（fā）症（zhèng）和多种（zhǒng）并（bìng）发症的加权平均分，发现在训（xùn）练（liàn）集和测试集中单（dān）一并发症（zhèng）和（hé）多种并发（fā）症（zhèng）病人的分数都有明显（xiǎn）差异。值得一提的是，有（yǒu）肾（shèn）病并发症和无（wú）肾（shèn）病并发（fā）症病人的分数（shù）也（yě）有明（míng）显差异（yì）。利用加权平均分作为判（pàn）断标准的受（shòu）试者工作（zuò）特征曲线（ROC）表明，在测试组中当将cutoff值设成0.69时，灵（líng）敏度（dù）为87.5%，特异性为68.8%。

5hmC标志物与传统临床变量/危险（xiǎn）因子的对（duì）比（bǐ）

我们评估了不同临床变量/危险因子用于监测血管并发症的（de）灵敏度和特异（yì）性（xìng）（见表1）。

信号通路分（fèn）析和功能探（tàn）究

有并发症和无（wú）并发症（zhèng）病人的（de）135个差异候选基因的功（gōng）能注（zhù）释分析（xī）表（biǎo）明，这些基因主要富集（jí）在一些经典的信号（hào）通路。错误发现率相关P值位于前10%和基因数目≥3的（de）信（xìn）号通路包括由IGF1R, IL-10和FGFR2所介导的（de）信（xìn）号通路。由IGF1R和IL-10介导（dǎo）的信号（hào）通路与胰岛素抵抗及炎症（zhèng）反应相（xiàng）关（guān），在血管生物学和糖尿病发生发（fā）展过程（chéng）中发挥重要作用。

Reactome相（xiàng）互作用（yòng）网络（luò）的（de）中心（xīn）表明，泛素（sù）编码基因[泛素（sù）B (UBB)，泛素C (UBC)，泛素A-52亚基（jī）核糖（táng）体（tǐ）蛋白融合产（chǎn）物1(UBA52)]是候选基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重（chóng）要连接者（zhě）。在（zài）这135个差异（yì）候选基因中, 一些基因 （如（rú）TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现出与糖尿病病程相关的倾向，表明5hmC和糖尿病血管并发症之间可能存在（zài）时间依赖性（xìng）的相互作（zuò）用。基于纵向时间队列（liè）的大（dà）样本研究，将可进一步明确5hmC变化和（hé）糖尿病持续时间之间（jiān）的动态（tài）关联（lián）。关于（yú）单一并发症和多种并（bìng）发症（zhèng）病（bìng）人的（de）159个（gè）候选标志基（jī）因的（de）功能注释（shì）研究发现，存在细胞-细胞连接、胶原（yuán）蛋白（bái）形成、新陈代谢、细胞应激应答信号通路（lù）的富（fù）集，这些（xiē）信号通路均与细胞（bāo）基本功能密（mì）切相（xiàng）关。

血管并发症是三分之二糖尿病病人的死（sǐ）亡（wáng）原（yuán）因，若（ruò）能及早有效控制血管（guǎn）并（bìng）发症的发生（shēng），将极大地改（gǎi）善糖尿（niào）病病（bìng）人的生存质（zhì）量。该研（yán）究建（jiàn）立了（le）一种利用cfDNA进行2型糖尿病血管（guǎn）并发症监测的无（wú）创便捷（jié）方法，较目前临床（chuáng）标志（zhì）物（wù）能（néng）更准确地监控血管并发症的发生，从而（ér）提示临床及早采取应对措施（shī），有效控（kòng）制病情（qíng）进展（zhǎn）。