2019年10月1日，5-羟（qiǎng）甲基化胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在（zài）糖尿（niào）病（bìng）研究领域取（qǔ）得重要进展。2型糖尿（niào）病（T2D）的（de）血（xuè）管并发（fā）症是导致2型（xíng）糖尿（niào）病致残致（zhì）死的重要病因，一（yī）直缺乏一种无创便捷（jié）的临床途径实现血管（guǎn）并发症的发生（shēng）发（fā）展（zhǎn）监测，达到早发现（xiàn）、早干预，以提高T2D病人（rén）的整体生活质量，减少卫生经济负担。

该研究入组了62例2型糖尿病病人，采用5hmC-Seal技术对血浆cfDNA中表观遗传标（biāo）志物5hmC的分布情况（kuàng）进行检测（cè），分（fèn）析（xī）5hmC标志物与2型糖尿病血管（guǎn）并发症发（fā）生（shēng）发展的相关性。结（jié）果表明5hmC标（biāo）志（zhì）物（wù）的（de）变化与T2D合并大血（xuè）管（guǎn）/微血管事（shì）件具有相关性，主要涉及一些与血管（guǎn）生（shēng）物学和糖尿病（包括胰岛（dǎo）素耐（nài）受和炎症反应）相关的基因和（hé）信号通（tōng）路。该（gāi）研究建立的16个基因-5hmC标（biāo）志（zhì）物组（zǔ）合检测可（kě）以准确区分有并（bìng）发症和无并发症（zhèng）的2型糖尿病病人（rén）[实验组：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优于传统临床变量例（lì）如白蛋（dàn）白尿。除此（cǐ）之外，还建立了13个基因-5hmC标志物组合检测，可（kě）以（yǐ）进一（yī）步区分T2D合并单一并发（fā）症和多种并发症[实验组（zǔ）：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样明显优于其（qí）他传统临床变量。该研（yán）究得出结论（lùn），5hmC标志物反映（yìng）了（le）T2D病（bìng）人大血管（guǎn）/微血管并发症发生过程中的表观遗传变化，因而（ér）5hmC-Seal检测技术在监测糖尿（niào）病血管并发症发生和进展方面具有（yǒu）良好（hǎo）的临床（chuáng）应用前景。

本（běn）研究共纳入62例（lì）2型糖尿病病人，包括没有血管并发症的病人12例，有单（dān）一血（xuè）管（guǎn）并（bìng）发（fā）症（zhèng）的病人34例（24例（lì）发生大血管（guǎn）事件，10例发生微血管事（shì）件），以及有多种血管并发症的病人16例。试验收集62例病人（rén）血浆，提取cfDNA，利用5hmC-Seal技术捕获外周血（xuè）cfDNA中的5hmC序列（liè），进行二代（dài）测序，通过（guò）生物信（xìn）息学分析找（zhǎo）出并发症（zhèng）组与无并发症组之间有显著5hmC修饰差异的基因，单（dān）一并（bìng）发症组和多种并发（fā）症组之间有显著（zhe）5hmC修饰差异（yì）的基因。随后利用（yòng）回归模型对差异基因进（jìn）一步筛（shāi）选（xuǎn）、优化，弹性（xìng）网络进（jìn）一步筛选（xuǎn），计算加权（quán）平（píng）均分，最（zuì）后（hòu）得到一组具（jù）有高度灵敏度和特异（yì）性（xìng）的5hmC生物标记物，并进一步在（zài）实（shí）验组（zǔ）中验证，分析其（qí）灵敏度和（hé）特异性。并将新建立的5hmC标志物基因（yīn）组（zǔ）合的检测性（xìng）能与传统临床变量进（jìn）行对（duì）比分析。最后（hòu）对（duì）相关基因进行了（le）信号通路分析和功能探究。

5hmC修（xiū）饰水平与血管并发症具有相关性

利用（yòng）逻辑回归模型对62例有（yǒu）并发症（zhèng）和无并发症2型糖尿病病人的5hmC差异水平进（jìn）行分析发现，有并发（fā）症2型（xíng）糖尿病病人的622个差（chà）异修饰候（hòu）选基因（yīn）（包括上调和下调基因）的归一（yī）化（huà）平均数要（yào）明显高（gāo）于无（wú）并发症的病人（P<0.001），但是单一并发症和多发并发症（zhèng）病人之间没有显著差异。

之后将有单一并发症或多种（zhǒng）并发症（zhèng）的50例（lì）病人用逻辑回归（guī）模（mó）型进行了对比（bǐ），发现（xiàn）多种并发症的（de）病人的（de）153个（gè）差异修饰候选基因（包括上调和下调基因）的归一化平均数要（yào）低于无并发症病人（P<0.001）。

5hmC标志物可区分（fèn）有无并发症患者

62例2型糖（táng）尿（niào）病（bìng）病人（rén）被（bèi）随机（jī）分成训（xùn）练组（zǔ）（n=31）和（hé）测试组（n=31）。利用弹性网（wǎng）络筛（shāi）选后发（fā）现，16基因-5hmC标志物组合检测可（kě）以（yǐ）用于区分（fèn）有并发症和无并发症（zhèng）的2型（xíng）糖尿病病人。

基于16基因组合模型 (Detection Model 1) 的加权平均（jun1）分（fèn）分析，发现无并（bìng）发症病人的分数在训练集和测试集中都明显低于（yú）有并发症的（de）病人。只考虑加权（quán）平（píng）均分（fèn）的话，受试者（zhě）工作特征曲线（ROC）分析表明将（jiāng）cutoff值设置成0.5时，在测（cè）试组中中的（de）灵敏（mǐn）度为60%，特异性为（wéi）100%。

5hmC标（biāo）志物（wù）可区分病人是单（dān）一（yī）并发症还（hái）是（shì）多种并（bìng）发症（zhèng）

50例有并（bìng）发症的2型糖尿病病人（rén）被随机分成（chéng）训练组（n=25）和（hé）测试组（n=25）。利用弹性网络筛选后（hòu）发现（xiàn），13基（jī）因-5hmC标志物组合可（kě）以区分2型（xíng）糖尿病病人是否（fǒu）发生单（dān）一并（bìng）发症或（huò）多种并发症。

基于13基（jī）因组合模（mó）型 (Detection Model 2)， 我（wǒ）们计算（suàn）了单一并发（fā）症（zhèng）和多种并发症的（de）加权平均分，发现在训练集和测试集中单一并发症和（hé）多种并发症病人的（de）分数都有明显差（chà）异。值得一提的是，有（yǒu）肾病（bìng）并发症和无肾（shèn）病并发（fā）症（zhèng）病（bìng）人（rén）的分（fèn）数也（yě）有明（míng）显差异。利用加权平（píng）均分作为判断（duàn）标准的受试者工作特征曲线（ROC）表明，在测（cè）试（shì）组中当将cutoff值设成0.69时，灵敏（mǐn）度（dù）为87.5%，特异性为68.8%。

5hmC标志物（wù）与传统临床变量/危险因子的对（duì）比（bǐ）

我们评估（gū）了不同临床变量/危险因（yīn）子（zǐ）用于监测血管（guǎn）并发症的灵敏度（dù）和特异性（见表（biǎo）1）。

信（xìn）号通路分析和功能探（tàn）究

有并发症和（hé）无并发症病人的135个（gè）差异候选（xuǎn）基因的（de）功能注释分（fèn）析表明（míng），这（zhè）些基因（yīn）主要富集在一些（xiē）经典的信号（hào）通路。错误发现率相关P值位于前10%和基因数目≥3的信号通路包括由IGF1R, IL-10和（hé）FGFR2所介导（dǎo）的信号通路。由（yóu）IGF1R和IL-10介导的（de）信号通路与胰岛（dǎo）素抵（dǐ）抗（kàng）及炎症（zhèng）反（fǎn）应相关，在血管生物学和糖尿病发生发展过程中发挥重（chóng）要作用（yòng）。

Reactome相互作（zuò）用网络的中心表明（míng），泛素编码基因[泛素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛素A-52亚基核糖（táng）体蛋白融合产物1(UBA52)]是候选基因（如（rú）SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重要连接者。在这135个（gè）差异候（hòu）选（xuǎn）基因中, 一些（xiē）基因 （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现出与糖尿病（bìng）病程（chéng）相关的倾向，表明5hmC和（hé）糖尿病血管并发（fā）症之间可能存在（zài）时间（jiān）依赖性的相互作用。基（jī）于（yú）纵向时间队列（liè）的大样本研究，将可进一步明确5hmC变化（huà）和糖尿病（bìng）持续时间之（zhī）间的动态关联。关（guān）于单一并发症和多（duō）种（zhǒng）并发（fā）症病人的159个候选标志（zhì）基因（yīn）的功能（néng）注释（shì）研究（jiū）发现，存在细胞-细胞连接、胶原（yuán）蛋白形成、新陈代谢、细胞（bāo）应激应答信号通（tōng）路的富集，这些信号通路（lù）均（jun1）与细胞基本功能密（mì）切相关。

血管并发症是三分（fèn）之二糖尿病病人的死亡原因，若能及早（zǎo）有效控（kòng）制（zhì）血管并（bìng）发症的（de）发生，将极大地（dì）改善糖尿病（bìng）病人（rén）的生（shēng）存质量。该（gāi）研究建（jiàn）立了一（yī）种利用cfDNA进行2型（xíng）糖尿病血管并发症监测的无创便（biàn）捷方法，较目前临（lín）床标志物能更准确地监（jiān）控血管（guǎn）并发症的发（fā）生，从而提示（shì）临床及早采取应对措施，有效（xiào）控制病情进展。